DA/T 26-2000

1范围
本标准规定了挥发性档案防霉剂防霉效果测试材料、仪器设备、测试条件、测试方法、结果评定等内容。
本标准适用于挥发性档案防霉剂防霉效果的测定。
2测试用品与设备
2•1用品
2•1•1培养基
2•1•2供试菌种
2•1•3受试底物
2•1•4医用喷雾器
2•1•5医用剪刀
2•1•6医用纱布
2•1•7小试管(l5mm╳l5Omm)
2•1•8培养皿(90mm)
2•1•9移液管(吸管)(lmL)
2•1.10三角烧瓶(25OmL、5OOmL)
2•1•11烧杯(25OmL、5OOmL、l0OOmL)
2•1•12量筒(1OOmL、5OOmL、l0OOmL)
2•1•13带盖的圆柱形玻璃器皿(容积约为12OOmL)
2•2设备
2•2•1手提医用消毒器
2•2•2架盘天平
2•2•3电热干燥箱
2•2•4恒温恒湿培养箱
2•2•5电冰箱
2•2•6无菌操作台或无菌室
3测试条件
3•1温度28oC±2oC。
3•2湿度RH≥93%。
3•3培养基
土豆汁培养基(配方见附录A)。
3•4菌种
杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)
黑曲霉(Aspergillus niger)
     产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
     桔青霉(Penicillium citrinum)
     球毛壳霉(Chaetomium globasum)
     腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)
     绿色木霉(Trichoderma viride)
     宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)
3•5菌量 (见附录C)
    混合孢子悬浮液浓度:1╳lO5个/mL～1XlO7个/mL。
3•6底物
    宣纸、卡纸、书写纸、牛皮纸、漆纸、漆布 (尺寸大小为2Omm╳3Omm)，胶片、录像带 (尺寸大小为自然宽度╳3Omm)。
3•7药量
    10OOmL体积中悬挂1.Og(即10OOmg)药物。
    3•8时间
   放置28天。
4测试方法
  4•1消毒器皿
      先用清水中加入数滴洗涤剂的洗洁液浸洗圆柱玻璃器皿，再用清水冲洗，最后用75%  乙醇涂擦消霉，待干，备用。
  4•2准备无菌水
      准备好带玻璃珠的无菌生理盐水和不带玻璃珠的无菌水若干瓶。即在25OmL三角瓶中注人1OOmL生理盐水，并放人几十粒玻璃珠，灭菌 (参见附录B)。在25OmL三角瓶 中注人2OOmL自来水，同样灭菌。
 4•3制备霉菌孢子悬浮液 (见附录D)
     在无菌室或无菌操作台，在火焰旁，用接种环分别挑取8株供试霉菌，接人带上述玻璃珠的无菌生理盐水中，用手振荡3min～5min，使孢子充分分散，复制成1╳lO5个/ mL～1XlO7个/mL的霉菌孢子悬浮液，备用。
 4•4放置样品 (见图1)
 4•4•1在适当的玻璃器皿内，悬挂受试底物，并喷洒霉菌孢子悬浮液(以表面湿润为宜)，
晾干，备用。
4•4•2在圆柱形玻璃器皿底部倒人2OOmL左右的无菌水(其目的是保持湿度，同时占去
多余容积，使玻璃器皿内的空间容积正好为10OOmL。
4•4•3将1.0g挥发性防霉剂用二层纱布或无纺布包裹后悬挂于玻璃器皿中央部位。
4•4•4在防霉剂周围悬挂受试底物 (间隔至少1cm，不能相互接触)
4•4•5将玻璃器皿瓶口用盖子盖紧 (或用透明复合塑料膜包扎)，保持密封。
4•4•6将玻璃器皿置于恒温恒湿培养箱内，在28oC±2oC，RH≥95%条件下，培养28天。
4•5空白对照
    在圆柱形玻璃器皿中央部位不悬挂挥发性防霉剂，重复上述步聚，作空白对照。
    当空白对照容器内的受试底物发霉严重时(即长霉程度++～+++)，测试有效，否则必须重做。

图1

5结果测定
    用肉眼观察长霉程度并进行等级评定 (见表1)。
                              
表1长霉程度和等级

菌丝生长情况	长霉程度	长霉等级
试样表面看不到菌丝生长	-	0级
试样表面看到菌丝生长，但菌丝生长面积不超过全面积的三分之一	+	1级
试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面积超过全面积的三分之一，但不超过全面积的三分之二	++	2级
试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面积超过全面积的三分之二	+++	3级

    
提示:长霉等级0级表示挥发性防霉剂防霉效果很好，1级表示效果较好，2级表示
效果较差，3级表示效果很差。

(2000-12-06批准  2001-01-01实施)

附录A
(标准的附录)
培养基的配制与灭菌
Al培养基的配制
     培养基从形式区分有固体培养基和液体培养基:从内容区分有合成培养基和天然培养基等。其配制步聚为:
    a)物料称量
     明确培养基的组成部分，根据需要配制的量计算好各成分的重量，逐一称取。
    b)溶解
    一般情况下，可将几种原料和药品一起放大烧杯内调匀，并定容到需要的体积。
    c)调节pH
    微生物生长需要合适的pH，通常用1mol/L(1 N)NaOH，1mol/L(1 N)HCl或0.5mol/L(l N)H2S04调节pH至5.0。调节时要慢慢滴入，不断用pH试纸检查，至所需要的pH为止。
    d)加热溶解
    配制固体培养基一般加入2%的琼脂(俗称洋菜)，与培养基一起加热溶解。加入琼脂后，须不断搅拌，以免琼脂粘底烧焦。
    e)过滤
    一般来说，培养基配制好后要过滤，滤去不溶物或块状物。过滤必须趁热进行，通常用4～6层纱布作滤层。无不溶物或块状物的培养基也可以不过滤。
    f)分装
    按照需要，分装进试管、培养皿或三角烧瓶中。一般只装到试管的1/5，培养皿中装入15mL～2OmL ，三角烧瓶装入一半量。
    g)加棉花塞或纱布、绒布扎口
    培养基灌装后，应在试管口或三角烧瓶口上加棉花塞或纱布、绒布扎口，其作用有二:一是阻止外界微生物进入，二是保证有良好的通气，以便微生物能不断获得无菌空气。
    h)包扎
    棉塞塞好后，试管扎成捆，同时在外面包扎上一层牛皮纸。三角烧瓶口也用牛皮纸包扎好，以防灭菌时冷凝水浸湿棉塞和灭菌后的灰尘侵入。
    i)灭菌
    一般情况下，培养基配制好后应立即灭菌，于1kg/cm2压力下消毒3Omin即可。如不及时灭菌，则应放人冰箱内保存。
    灭菌时，必须先将压力器内的空气排放干净，否则，即使压力到了所规定的数值，还是达不到所需要的温度。
    j)定形
    固体培养基温度降到一定程度时便凝固成形。
A2霉菌培养基配方
    霉菌培养基配方有多种，本标准采用土豆汁培养基，配方如下:
    土豆 (去皮)200g、水10OOmL、琼脂20g、pH5.0
    将土豆洗净去皮，称取200g，切成小块，加10OOmL水煮沸1h，用双层纱布滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分。
附录B
(提示的附录)
玻璃器皿的清洗与灭菌
Bl玻璃器皿的清洗
    对买来的新试管、移液管、培养皿、三角烧杯、烧杯等玻璃器皿，先用水冲洗，然后放在5%的碱溶液内洗刷，再放在3%的盐酸溶液内中和，最后用水冲洗，晾干或烘干即可。
    培养或污染过微生物的玻璃器皿，在洗涤之前，必须先进行消毒。一般采用高压灭菌，也可用常压煮沸或其他化学药品消毒。消毒后，将脏的培养物或其他污染物去掉，然后用清水冲洗，再在肥皂水中洗刷，最后用清水冲洗干净，晾干或烘干即可。
    遇有不易洗刷干净的玻璃器皿，则可用硫酸重铬酸钾洗液浸渍后再清洗。其配方是:粗硫酸9OOmL，重铬酸钾 (粗制)1OOg，自来水1OOmL。配制顺序是:先将自来水和重铬酸钾置于烧杯中，加热溶化，待冷却后，再以细流加入硫酸即可。
    若玻璃器皿上有橡皮胶、封蜡、凡士林等物时，应另外处理，然后再按上述清洗过程洗涤。
B2玻璃器皿的灭菌
    微生物试验中所用的玻璃器皿都可以采用高压灭菌。清洗干净的玻璃器皿晾干或烘干后分别进行封口、包扎，然后灭菌。
    培养皿一般用牛皮纸包裹(10套一包)，用线扎牢，或装入特制的铝皮盒内。试管应先加棉花塞(采用脱脂棉)，棉塞的大小松紧要适宜，以便操作时易于拔取和塞回。最后装进试管筐内，上面包以牛皮纸。吸管 (移液管)管口应先塞少许棉花，以免使用不慎将微生物吸入口中或橡皮吸球内。然后每支吸管都先用薄纸包卷，每10支吸管用牛皮纸包扎好。三角烧瓶瓶口用绒布 (或几层纱布)及牛皮纸包扎好。其他玻璃器皿也都用牛皮纸包裹后再进行灭菌。
    准备工作做好后，将玻璃器皿置高压灭菌器内，在1kg/cm2压力下消毒45min即可。灭菌后，取出，烘干，备用。
    试管、培养皿、三角烧瓶等玻璃器皿以及金属用具也可施行干热灭菌。先用水洗涤干净，待干燥后塞上棉花或绒布，用牛皮纸包扎好，置电热干燥箱内，加热至15OoC～170oC，约保持1h～2h。
附录C
(提示的附录)
活菌计数
C1步聚
    a)用灭菌吸管吸取1mL霉菌孢子悬浮液注入9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液体)，充分混匀，制成1:10稀释菌液。
    b)用灭菌吸管吸取1mL1:10的霉菌孢子稀释液注入到另一支9mL灭菌生理盐水试管中，充分混匀，使成1:100稀释菌液。
    c)根据霉菌孢子悬浮液的浓度，用同样方法，制成1:1 000、1:10 000、1:100 000、1:1 000 000,1:10 000 000等稀释菌液 (每次稀释应更换一支来菌吸管)。
    d)用灭菌吸管吸取上述稀释液各1mL分别注入灭菌培养皿中，每种稀释度应做3～5块培养皿。
    e)将溶化并冷却至450C左右的霉菌琼脂培养基放人各培养皿内 (每皿约15mL～2OmL)，随即晃动培养皿，使菌液与培养基充分混合，平放，待凝固。
    f)将培养基凝固后的培养皿置于280C±20C的恒温培养箱内培养2～3天，取出，观察菌落并计数。
C2要求操作必须在无菌室或无菌箱内进行。
C3计数
    用肉眼观察，点数菌落数。由于霉菌不同于细菌和酵母，其菌落大，且扩展快，故计数时依每皿5～10个菌落为宜，少于或超过这一数字的培养皿可不作计数。每种稀释度的3～5块培养皿取其平均值。
    应使用下列公式:
式中： X=(S/N)•M(个/mL)
X——每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数;
S——稀释度培养皿上出现的菌落总数;
N——培养皿的数目;
M——稀释倍数。
    示例:
    1:10 000 000(即1╳10-7)稀释度5块培养皿上出现的菌落数分别为6、10、7、9、8，则每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数为:
    X=[(6+10+7+9+8)/5]╳lO 000 000=80 000 000个/mL，即8╳107个/mL附录D
(提示的附录)
菌株接种与保藏
Dl接种
    菌株接种常用接种环或接种针。接种过程必须执行严格的无菌操作，通常在无菌室或无菌操作台上进行，并靠近火焰 (煤气灯或酒精灯)操作。
    斜面接种是从已生长好的菌种斜面上用接种环 (或针)挑取少许菌落，把它们移接到另一支新鲜斜面培养基上。具体步聚是:
    手持试管斜面→旋松棉塞→取接种环→拔棉花塞→环灼烧冷却→挑取菌种→接种→塞棉花塞→接种环灭菌。
    将接种过的斜面培养基置于28oC±2oC恒温中培养，3～5天后取出。
D2保藏
    菌种保藏方法有多种，常用的是斜面菌种保藏法。
    霉菌一般保藏在土豆琼脂斜面或察氏琼脂斜面。通常存放于20C～40C的冰箱或冰库中，用此法可保存3个月，即3个月以后必须重新移植一次。